close

Вы успешно подписаны на нашу рассылку.

Подписаться

* Нажимая кнопку, я соглашаюсь с политикой обработки данных

Электропорация

13.08.2017
eye 410

Электропорация — создание пор в бислойной липидной мембране под действием электрического поля. Это явление используется в биотехнологии для внедрения макромолекул (обычно ДНК или РНК) в клетки.

Усиление электрического поля при электропорации

Явление электропорации основано на том, что мембраны обладают способностью концентрировать электрическое поле. Пусть между двумя плоскими параллельными электродами, находящимися на расстоянии L приложена разность потенциалов U и промежуток между ними заполнен слабо проводящим электролитом, тогда напряженность поля равномерно распределена по всему пространству между ними. А теперь поместим в центре ячейки бислойную липидную мембрану, которая обладает настолько высоким сопротивлением, что ее можно рассматривать как непроводящий диэлектрик. Тогда вся разность потенциалов U окажется сконцентрирована на мембране.

Коэффициент усиления электрического поля, очевидно, будет равен L/h ~ 10^6, если выбрать L ~ 1 см, h ~ 5 нм. Таким образом, в согласии с экспериментальными результатами, достаточно приложить к электродам разность потенциалов порядка сотен милливольт, чтобы вызвать электропорацию бислоя. Если теперь между электродами находятся клетки с диаметром порядка 10 микрон, и мы хотим вызвать их электропорацию, придется приложить значительно более высокие напряжения. Действительно, в силу высокого сопротивления мембраны, раствор в клетке будет эквипотенциальным, то есть внешнее поле будет экранировано подвижными ионами, которые образуют диффузные обкладки двойных электрических слоев. Таким образом, на клетке скачок напряжения составит 2UR/L, которое будет сконцентрировано на мембране в области двух полюсов клетки. Если принять, что надо иметь, скажем 0.5 В, то приложить к электродам надо будет U ~L/R*0.5 В. Тем самым, имея L ~ 1 см, R ~ 5∙10^-4 см, получим U ~ (1∙0.5)/(5∙10^(-4)) ~ 1 кВ. Поэтому в экспериментах с суспензиями клеток и липосом, приходится использовать специальные электропораторы, которые способны генерировать короткие импульсы амплитудой до 1-10 кВ.

При приложении к суспензии клеток импульсов электрического поля с напряженностью от нескольких сотен до нескольких тысяч вольт на см и длительностью от десятков микросекунд до десятков миллисекунд удается вызвать резкий рост проводимости клеточных мембран. После умеренной электрообработки проводимость клеток снижается до нормальных значений за времена от нескольких секунд до нескольких минут. Более интенсивная электрообработка приводит к необратимому разрушению части клеток.

В экспериментах с клетками сложно контролировать напряжение, прикладываемое непосредственно к клеточной мембране. Кроме того, клеточная мембрана является чрезвычайно сложной системой. Основные барьерные функции мембраны выполняются фосфолипидным бислоем, который пронизан белками, выполняющими роль селективных каналов или активных насосов для ионов и метаболитов. Возможными причинами роста электропроводности могли бы быть изменения как в липидном бислое, так и в белках. Эксперименты c искусственной бислойной липидной мембраной (БЛМ) показали возможность ее электрического пробоя при напряжениях близких к тем, при которых пробой наблюдается в клеточной мембране. Было показано, что электрический пробой БЛМ определенного состава может быть обратимым. Это указывает на то, что именно пробой по липидной компоненте ответственен за повышение проницаемости клеток. Эксперименты с БЛМ показали, что электрический пробой возникает стохастично, и среднее время жизни мембраны нелинейно зависит от напряжения. Эти наблюдения привели к разработке теории образования и развития пор в жидких липидных бислоях в электрическом поле. В конце 1990х годов удалось с помощью высокоточных измерений проводимости мембран зарегистрировать появление одиночных электропор в БЛМ. Их средний диаметр составляет примерно 0.5 нм. В клеточных мембранах они были обнаружены с помощью электронн

Теория электропорации мембран

Теория электропорации БЛМ предполагает, что в бислойной липидной мембране возникает локальная перестройка структуры, приводящая к появлению сквозного водного канала. Возможны две основных конфигурации поры — гидрофильная и гидрофобная. В гидрофобной поре стенки поры выстланы липидными «хвостами», а в гидрофильной поре — фосфолипидными головами. При малых радиусах энергетически выгодной является гидрофобная пора, при больших радиусах — гидрофильная пора. Вода обладает большей диэлектрической проницаемостью, чем липиды. Поэтому мембрана, содержащая поры, обладает меньшей энергией во внешнем электрическом поле. Этот выигрыш энергии пропорционален площади поры и квадратичен по ее радиусу. При радиусе поры r* энергии гидрофобной и гидрофильной пор становятся равными. На энергетической кривой существует локальный минимум, отвечающий метастабильному проводящему состоянию бислоя, из которого он, с определенной частотой переходит в начальное невозмущенное состояние с низкой проводимость системы, или претерпевает разрыв.

Предполагается, что скорость зарастания пор не зависит от приложенного электрического поля и от плотности пор на бислое. Данное предположение хорошо согласуется с экспериментально наблюдаемыми фактами.

Доставка макромолекул в клетки при электропорации

Описанные выше опыты фактически сводились к измерению электрического тока, переносимого малыми ионами через поры. Наряду с этим было установлено, что электрообработка способствует переносу через мембраны и макромолекул, размер которых превышает диаметр электропор. Более того, отмечалась корреляция между электропорацией и переносом крупных молекул. Эта загадка была решена на примере транспорта молекул ДНК было доказано, что они способны расширять поры, которые затем медленно (~ 100 сек.) релаксируют к исходному состоянию. Кроме того, прямыми опытами там же было показано, что электрофорез ДНК играет важнейшую роль не только на стадии переноса этих молекул к клетке, но и при прохождении через мембрану. Электрическое поле буквально вдавливает плазмидную ДНК в малую пору, при этом расширяя ее. Можно сказать, что сами молекулы плазмидной ДНК играют роль золотых микроскопических пуль, которые используются в методе «gene gun». Только движущие силы имеют разную природу — электрическую в первом случае, механическую во втором. Еще одно важное новшество состоит в применении 2х-импульсной методики электрообработки, которая позволила разделить во времени две функции поля — электропорационную и электрофоретическую. Первый импульс был мощным, но коротким; затем следовал интервал переменной длительности и, наконец, включалось слабое постоянное поле. Введение ДНК перед первым импульсом приводило к высокой трансфекции и переносу крупных молекул декстранов, тогда как введение ДНК во время межимпульсного интервала не давало практически никакого эффекта.

В последнее десятилетие электропорацию стали применять для трансдермального переноса лекарственных веществ в организм человека. Электропорация лежит в основе нескольких методик трансдермального переноса, которые называют аквафорез, неинвазивная мезотерапия, безыгольная мезотерапия или безинъекционная мезотерапия.



Поделиться



Вы успешно подписаны на нашу рассылку.